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      血液里的循環(huán)DNA是可以指導(dǎo)抗癌治療的，不過前提是科研人員們先研究出來如何才能夠最好地利用這些分子。

      2012年，Charles Swanton不得不直面腫瘤最“卑劣的”詭計。Swanton是英國倫敦癌癥研究所（Cancer Research UK London Research Institute）的科研人員，他們團隊對大量的腎癌樣品進行了DNA測序研究工作，希望能夠找到一些新的突變位點，但是單單在一個腫瘤里發(fā)現(xiàn)的遺傳變異就讓他們徹底驚呆了，他們沒想到能夠發(fā)現(xiàn)這么多的突變。在一個腫瘤組織里，一個部位的細胞就和另外一個位置上的細胞完全不一樣，在同一個組織中，只有大約1/3的突變是所有腫瘤細胞共有的突變�；颊呱眢w里其他位置上的轉(zhuǎn)移癌也與原發(fā)灶完全不同。

       這一研究結(jié)果證明，過去被我們看作是腫瘤診斷金標準的組織活檢（tissue biopsy）檢查也是遠遠不夠的，這就好像通過對一條街道的調(diào)查來推測整個國家的情況一樣可笑。組織活檢會漏掉很多信息，比如離活檢部位幾厘米之外的組織信息就無法檢測到，但是這些信息可能就會決定患者的生死。雖然組織活檢可以給我們提供一些腫瘤特異性的突變信息，根據(jù)這些信息也有可能找到效果比較好的抗癌治療手段和措施，但是這些信息都只是“靜態(tài)的”信息，不能夠準確地反映整個腫瘤組織的全貌。

       Swanton等人的研究成果更是讓腫瘤遺傳變異性變成了一道不可逾越的鴻溝。Swanton表示：“坦率的說，我們對此結(jié)果感到非常的沮喪，如果我們使用分辨率更高一些的檢測方法，會發(fā)現(xiàn)腫瘤的遺傳復(fù)雜性實際上更加超出我們的想象。”

      不過科研人員們也找到了一些辦法，對患者體內(nèi)的腫瘤有了更加豐富的了解，甚至能夠?qū)�這些腫瘤跟蹤一段時間。當(dāng)腫瘤細胞死亡、裂解之后，它們會釋放出細胞內(nèi)的物質(zhì)，其中就包括循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumour DNA, ctDNA），即在人體血液循環(huán)系統(tǒng)中不斷流動的腫瘤基因組片段DNA。正常細胞的碎片通常都會被巨噬細胞（macrophages）等“清道夫細胞（cleaning cell）”吞食、清理掉，但是腫瘤細胞往往都比較大，而且增殖迅速，所以清道夫細胞都難以將腫瘤細胞徹底吞食、消化掉。

      科研人員們經(jīng)過不斷的努力，開發(fā)出了能夠?qū)ρ�環(huán)腫瘤DNA進行檢測，并測序的新技術(shù)。這樣就將一瓶瓶血樣變成了液體活檢標本（liquid biopsies），而且與傳統(tǒng)的組織活檢技術(shù)相比，這種液體活檢能夠更加全面地反映腫瘤的特征。而且在一段時間之后重復(fù)進行液體活檢還可以了解抗癌治療是否起效，或者腫瘤是否出現(xiàn)耐藥性等多種信息。

       不過和以前一樣，這種新技術(shù)也有其局限性。ctDNA的水平有非常大的個體差異，而且很難檢測，在疾病初期，腫瘤體積還較小時尤其明顯。另外，到目前為止，開展的相關(guān)研究基本上都只是選擇了幾個，或者幾十個患者進行實驗，而且關(guān)注的腫瘤類型也比較有限，只是那幾種疾病而已。雖然這些實驗的結(jié)果都很不錯，但是還需要進行更大規(guī)模的研究，驗證這種ctDNA檢測方法是否能夠真實地反映出最準確的腫瘤信息。更重要的一點是，還需要進行更大規(guī)模的研究來驗證這種方法是否真的能夠挽救癌癥患者的生命，或者改善他們的生存質(zhì)量。美國馬里蘭州約翰霍普金斯大學(xué)（Johns Hopkins University in Baltimore, Maryland）的腫瘤學(xué)家Luis Diaz就認為：“僅僅監(jiān)測腫瘤還遠遠不夠，我們現(xiàn)在面臨的問題是找到這種技術(shù)最切實有效的應(yīng)用途徑�！�

      美國約翰霍普金斯大學(xué)的遺傳腫瘤學(xué)家Victor Velculescu也認為，如果科研人員能夠全部解決以上這些問題，那么液體活檢技術(shù)就可以幫助臨床醫(yī)生們選擇更好的治療方案，而且在治療過程中及時做出調(diào)整�！岸�且這種新技術(shù)還可以幫助我們找到新的抗癌治療靶點。讓個性化醫(yī)療成為現(xiàn)實，這是一個徹底改變游戲規(guī)則的新技術(shù)�！� Velculescu這樣說道。

      遲來的行動

       早在1948年就有人報道過在人體的血液中存在循環(huán)DNA，到了1977年，又有人指出在腫瘤患者的血液中更加容易發(fā)現(xiàn)循環(huán)DNA。可是又花了17年，我們才發(fā)現(xiàn)這種攜帶了突變信息的循環(huán)DNA是腫瘤的標志，因為科學(xué)家們證明這些DNA的確來自體內(nèi)的腫瘤細胞。

      可是世界上第一個使用循環(huán)DNA的卻不是腫瘤學(xué)家。中國香港中文大學(xué)（Chinese University of Hong Kong）的化學(xué)病理學(xué)家Dennis Lo第一個想到，既然腫瘤能夠釋放DNA入血，那么胎兒肯定也可以。1997年，Lo成功地證明一個孕婦的外周血液中含有來自她體內(nèi)男性胎兒的Y染色體。這一發(fā)現(xiàn)讓醫(yī)生們能夠在妊娠初期就可以鑒別出胎兒的性別，也可以不使用侵入式檢查方式（invasive testing）查出胎兒是否患有唐氏綜合癥（Down’s syndrome）等發(fā)育疾�。╠evelopmental disorders）。這對整個產(chǎn)前診斷（prenatal diagnostics）領(lǐng)域都是一場革命。

      英國劍橋癌癥研究院（Cancer Research UK Cambridge Institute）的基因組學(xué)專家Nitzan Rosenfeld指出，不過腫瘤更難被‘抓住’。其中一部分原因就是因為和胎兒循環(huán)DNA相比，腫瘤循環(huán)DNA更難以被檢測到。通常來說，血液里的循環(huán)腫瘤DNA更少，而且數(shù)量變異度非常大。對于極晚期癌癥患者，腫瘤組織是他血液中循環(huán)DNA的主要來源，但是一般情況下，ctDNA只占整個循環(huán)DNA的1%，甚至只有0.01%。早期的基因測序技術(shù)是無法測定這么微量的DNA的，至少在測序的穩(wěn)定性和可靠性方面還不足以讓循環(huán)DNA成為一種生物標志物。

      近十年來，DNA測序技術(shù)有了飛速的發(fā)展，靈敏度得到了大幅提升，已經(jīng)能夠檢測到痕量的DNA分子，并且對其進行定量分析。比如，借助BEAMing這種DNA擴增技術(shù)就可以檢測到每1萬個健康細胞DNA中的那一個ctDNA分子。這種BEAMing技術(shù)可以將循環(huán)DNA吸附到磁珠上，然后將其分離并進行檢測。

      美國約翰霍普金斯大學(xué)的遺傳腫瘤學(xué)家Bert Vogelstein和Kenneth Kinzler也開發(fā)出了一種新技術(shù)，他們在2007年發(fā)表論文，介紹了對18名正在接受治療的腸癌患者的檢測結(jié)果，他們使用這種新技術(shù)對這些患者體內(nèi)的ctDNA進行了跟蹤研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，手術(shù)治療之后，患者體內(nèi)的ctDNA水平降低了99%，但是有些病人體內(nèi)的ctDNA并沒有完全消失。在第一次隨診時還是能夠檢測到體內(nèi)ctDNA信號的患者中，除了1人之外，其他的所有人最后都出現(xiàn)了腫瘤復(fù)發(fā)的情況。不過在術(shù)后檢測不到ctDNA的患者中則沒有一例復(fù)發(fā)。

      這些結(jié)果表明，ctDNA能夠告訴我們，手術(shù)治療對患者的治療效果如何，患者在術(shù)后是否需要接受化療，殺死殘余的腫瘤細胞等等信息。隨后，科研人員們也對其它多種腫瘤患者進行了同樣的研究，也得到了非常類似的結(jié)果。Rosenfeld與他在英國癌癥研究院的同事James Brenton 和Carlos Caldas一起發(fā)現(xiàn)，ctDNA能夠準確地揭示晚期卵巢癌和乳腺癌的特性。在一項迄今為止規(guī)模最大的科研項目中，Diaz和美國約翰霍普金斯大學(xué)的其他幾名同事一起發(fā)現(xiàn)，在患有胰腺癌、膀胱癌、皮膚癌、胃癌、食道癌、肝癌和頭頸部腫瘤等各種癌癥的晚期患者人群中，至少有75%的患者能夠檢出ctDNA。不過腦癌（Brain cancers）是一個比較值得一提的例外，因為血腦屏障的原因，顱內(nèi)腫瘤的DNA無法進入外周血液循環(huán)當(dāng)中。

      更好的生物標志物

      數(shù)十年來，科研人員們一直都在尋找能夠很好地反映腫瘤情況的生物標志物，與蛋白質(zhì)類生物標志物相比，循環(huán)DNA的表現(xiàn)應(yīng)該會更好。在臨床工作中，蛋白質(zhì)已經(jīng)被用來診斷疾病，或者監(jiān)測治療效果。比如前列腺特異性抗原（prostate-specific antigen, PSA）就是前列腺癌的生物標志物。但是PSA檢測會出現(xiàn)假陽性結(jié)果，因為也有其它原因會導(dǎo)致血液中的PSA增加�？墒莄tDNA檢測出現(xiàn)假陽性結(jié)果的可能性就要低得多，因為我們不是檢測ctDNA的水平，而是檢測它是否攜帶有腫瘤特異性的突變，或其它基因組改變信息。另外，大部分蛋白質(zhì)類生物標志物都可以在血液中存留數(shù)周的時間，但是ctDNA的半衰期卻還不到2小時，所以能夠更加明確地反映出腫瘤近期的信息，而不是很久以前的情況。英國劍橋和美國約翰霍普金斯大學(xué)的科研團隊已經(jīng)分別發(fā)現(xiàn)，在檢測乳腺癌和腸癌方面，ctDNA要比蛋白質(zhì)類生物標志物更加靈敏，而且在追蹤腫瘤轉(zhuǎn)歸、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)方面，ctDNA的準確度也更高。

      美國和英國的這兩個科研團隊還發(fā)現(xiàn)，ctDNA要比循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumour cell）更加靈敏，所謂循環(huán)腫瘤細胞指的就是在血液循環(huán)系統(tǒng)中的完整腫瘤細胞，這也是一大研究熱點。Diaz等人在一個16人的亞組研究工作中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)同時能夠檢出ctDNA和循環(huán)腫瘤細胞時，ctDNA的數(shù)量是循環(huán)腫瘤細胞的50倍。而且能夠檢出循環(huán)腫瘤細胞就一定可以檢出ctDNA，但是有13個人卻只能夠檢出ctDNA，而找不到循環(huán)腫瘤細胞。

      不過Diaz認為，ctDNA檢測最讓科研人員們激動的還是它能夠跟蹤腫瘤的演變和轉(zhuǎn)歸，他說道：“該技術(shù)能夠幫助我們回答很多在之前一直找不到答案的腫瘤學(xué)問題�！�

      比如，為什么有那么多靶向治療藥物最終都是以失敗告終？吉非替尼（Gefitinib）和帕尼單抗（panitumumab）就是著名的表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）抑制劑類靶向治療藥物，我們都知道EGFR是一種涉及細胞生長和分裂的蛋白質(zhì)，在多種腫瘤細胞中都有過度活化的現(xiàn)象。患者使用這類藥物治療之后最開始都會獲得非常明顯的治療效果，但是幾個月之后就會出現(xiàn)耐藥的情況，最常見的情況就是因為KRAS基因（該基因在多種腫瘤中都會出現(xiàn)突變）發(fā)生改變。

      在臨床上，為了監(jiān)測患者的病情，并且決定下一步的治療方案，臨床醫(yī)生們往往需要進行多次組織活檢。但是晚期癌癥患者體內(nèi)卻經(jīng)常有多個腫瘤組織需要活檢，而且一個腫瘤組織的不同部位往往也會表現(xiàn)出不同的耐藥特性。這種組織活檢是一種侵入式的、有創(chuàng)的檢查手段，操作上存在一定的風(fēng)險，而且像肺臟等較脆弱的組織也很難進行組織活檢檢查。所以Velculescu認為，患者治療失敗之后，你不能夠跟病人說，我們再做5次活檢吧。但是采血進行液體活檢可就簡單多了。

      2012年，Diaz的課題組報道了他們使用ctDNA技術(shù)對接受EGFR抑制劑類藥物治療的腫瘤患者進行研究的結(jié)果。他們一共發(fā)現(xiàn)了42種不同的，與耐藥相關(guān)的KRAS基因突變，平均來說，ctDNA技術(shù)能夠比影像學(xué)檢查提早5個月發(fā)現(xiàn)腫瘤的進展情況。Diaz他們重點觀察的是KRAS基因突變，而Rosenfeld等人在用ctDNA技術(shù)尋找耐藥突變時則沒有預(yù)設(shè)的目標。去年，Rosenfeld的課題組介紹了他們對6名正在接受治療的晚期乳腺癌、肺癌、或卵巢癌患者血樣開展的全外顯子組（即基因組中負責(zé)編碼蛋白質(zhì)的序列，在整個基因組中大約占到1%）測序研究工作。其中有5個病例都發(fā)現(xiàn)了耐藥機制，比如有外顯子發(fā)生突變，導(dǎo)致抗癌藥不能與靶蛋白結(jié)合，所以出現(xiàn)耐藥。

      盡早發(fā)現(xiàn)耐藥情況可以幫助臨床醫(yī)生們避免給患者使用昂貴、有毒副作用，而且治療效果也不好的藥物。通過發(fā)現(xiàn)這些耐藥突變，就可以找到其他的有效方案，或者制定出組合治療方案。Velculescu說道：“我們有望將癌癥這種致死性的疾病變成一種慢性疾病。我們可以選擇一種抗癌藥進行治療，等這種藥物失效之后，我們再換另外一種藥�！�

      臨床應(yīng)用上的限制

      盡管ctDNA技術(shù)的前景非常光明，但是目前還不太適合應(yīng)用于臨床。因為目前最靈敏的ctDNA檢測技術(shù)，比如BEAMing等技術(shù)依賴的都是已經(jīng)非常明確的待測突變。但是這些突變信息還是只能通過組織活檢的方法才能夠獲得。也就是說，我們只能先進行組織活檢，對標本進行測序，發(fā)現(xiàn)突變位點信息之后，根據(jù)這些突變信息設(shè)計出特異性的探針，然后才能夠進行ctDNA液體活檢。每一個病人都得經(jīng)歷這一過程。不過也可以像Rosenfeld等人那樣進行全外顯子組測序。這就不需要預(yù)先知道突變信息，但是目前進行這種測序的成本非常高，還不太現(xiàn)實。

      美國斯坦福大學(xué)（Stanford University in California）的腫瘤放療專家Maximilian Diehn嘗試過將這兩種研究策略結(jié)合到一起。他們發(fā)現(xiàn)在肺癌患者的基因組中，有一小部分（只有0.004%）片段總是會出現(xiàn)突變。所以他們只要拿到一份新的肺癌患者血樣，就會對這個片段進行檢測——1萬多次測序。這樣就可以發(fā)現(xiàn)非常罕見的突變，而且檢測成本會大大降低。Diehn認為，因為差不多每一名肺癌患者基因組中的這個區(qū)域至少都會存在1種突變，所以這種方法適用于每一位肺癌患者。他們課題組現(xiàn)在正在對其他類型的腫瘤開展研究，希望找到類似的突變位點，并且進行臨床實驗，驗證他們的發(fā)現(xiàn)，不過這還需要好幾年的時間。

      與其他的ctDNA活檢技術(shù)一樣，Diehn的這種方法對于早期腫瘤患者的檢測效果也不太好。在一項小型研究中發(fā)現(xiàn)，這種技術(shù)對于2期及更晚期的患者具有100%的檢出率，但是對于1期患者，檢出率只有50%。這也很容易理解，因為晚期腫瘤釋放的ctDNA更多，但是這的確限制了ctDNA檢測技術(shù)在臨床上的應(yīng)用，使其還不能夠成為一種癌癥篩查手段。

      Diehn認為，靈敏度更高的檢測技術(shù)可以解決這個問題，不過Diaz卻不贊成這個觀點。Diaz說道：“限制因素是生物學(xué)本身。在循環(huán)血液中就沒有足夠的DNA片段。如果ctDNA檢測提示我們，體內(nèi)存在腫瘤，那又如何呢？因為即便在血液中檢出了腫瘤突變，我們還是不知道原發(fā)灶在哪啊。”

      此外，還存在其他的不確定因素。比如ctDNA能夠真實地反映出腫瘤的特性嗎？腫瘤轉(zhuǎn)移灶細胞也會釋放出和原發(fā)灶一樣多的ctDNA嗎？腫瘤組織中的每一個腫瘤細胞是否都會釋放出同樣多的ctDNA？Diaz認為要找到這些問題的答案，唯一的方法就是進行“死亡后及時尸檢（warm autopsies）”，在患者死后的第一時間將患者體內(nèi)的腫瘤組織取出，進行分析，并且將分析結(jié)果與ctDNA檢測結(jié)果進行比對�！斑@是我們接下來將要開展的重要工作�！� Diaz說道。

      可是最大的問題還是沒有解決，ctDNA檢測能否準確地反映體內(nèi)的腫瘤負荷（tumour burden），能否實時的再現(xiàn)新發(fā)的突變，真的能夠挽救患者的生命，或者改善患者的生存質(zhì)量？即便臨床醫(yī)生們發(fā)現(xiàn)患者體內(nèi)的腫瘤出現(xiàn)了耐藥突變，如果沒有針對這種突變的藥物，醫(yī)生們也還是束手無策。所以Velculescu認為，最大的困難還是在靶向治療藥物方面。就算你掌握了所有信息，又能怎么辦？我們對于腫瘤的研究手段已經(jīng)遠遠地領(lǐng)先于臨床醫(yī)生們在實際工作中的需要，他們現(xiàn)在手頭上可供選擇的治療方案還非常少。

      即便ctDNA檢測目前還不能夠改變癌癥患者的預(yù)后，科學(xué)家們還是將這種技術(shù)看作是一個非常重要、非常有價值的科研手段。臨床醫(yī)生們也已經(jīng)開始將收集ctDNA標本當(dāng)作了一項臨床常規(guī)操作。比如Swanton就正在領(lǐng)導(dǎo)一個投資1400萬英鎊，約合2400萬美元，名為“在治療中跟蹤腫瘤演進（Tracking Cancer Evolution Through Therapy, TRACERx）”的肺癌研究項目。他們將使用傳統(tǒng)的組織活檢技術(shù)和每3個月一次的ctDNA檢測技術(shù)開展研究。循環(huán)DNA有可能會（也可能不會）給我們提供有價值的線索，對患者進行研究。但是無論如何，至少可以讓Swanton更清晰地了解和認識肺癌的演進過程，以及如何控制腫瘤的演進。

      Rosenfeld也認為，有這種信息總比沒有好。他最近表示：“我們正在黑暗中摸索。如果你有辦法看到黑暗中正在發(fā)生什么，為什么不用呢？”